6月10日，国际学术期刊Communications Biology在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）丛尧研究组题为 “An immobilized antibody-based affinity grid strategy for on-grid purification of target proteins enables high-resolution cryo-EM”的研究论文。该研究应用Pyr-NHS作为接头（linker），结合高亲和力的PA标签/NZ-1抗体系统，发展了锚定抗体的亲和载网（IAAG）策略，成功实现了直接从细胞裂解液中亲和纯化低丰度的目标蛋白进行冷冻制样。这一方法极大地简化了样品纯化过程，并实现了原子分辨率冷冻电镜结构解析，显示该方法在冷冻电镜结构研究中具有广泛的应用潜力。

近年来，随着分辨率革命的到来，冷冻电镜（cryo-EM）技术已成为生物大分子结构研究的强有力工具。然而，很多生物大分子复合体丰度低、不稳定，且易受与气-液界面（AWI）相关的取向倾向性或聚集等问题的影响。因此，冷冻样品制备尤其是针对上述复合体的制备已成为cryo-EM的主要技术瓶颈。亲和载网方法，甚至应用亲和载网进行在网（on-grid）的目标蛋白纯化，是解决上述问题的一种极具潜力的方案。然而，现有的亲和载网制备方法及应用过程复杂繁琐，需要特殊的处理或工具，以及丰富的用户经验。此外，初始的应用亲和载网进行 on-grid 纯化样品的尝试，其应用范围和解析目标样品的分辨率有限（大多数分辨率限制在 8-40 Å）。因此，迫切需要开发一种更有效且用户友好的亲和载网方法，用于on-grid样品纯化，克服AWI引起的相关问题，同时有助于实现高分辨率的冷冻电镜结构解析。

为了解决上述问题，该研究发展了一种基于高亲和力PA标签/NZ-1抗体系统的锚定抗体的亲和载网（IAAG）策略。研究人员使用了小分子交联剂Pyr-NHS，其一端可通过π-π相互作用非共价锚定到具有sp²杂化碳晶格的碳/石墨烯/氧化石墨烯（GO）覆盖的载网表面；另一端具有生物活性酯基团，可与NZ-1的Fab片段或其他抗体及蛋白质中的伯胺发生反应，形成稳定的酰胺键，将目标分子固定于载网表面，从而完成IAAG亲和载网的组装。采用IAAG亲和载网策略，不仅能够对PA 标记的目标蛋白进行富集，实现了原子分辨率冷冻电镜结构解析；而且如冷冻电子断层扫描（cryo-ET）分析显示样品均分布于承载膜附近，从而克服了气-液界面引起的取向倾向性问题。值得注意的是，应用IAAG策略，研究人员成功实现了从细胞裂解液中直接on-grid纯化低丰度的目标复合体进行冷冻制样，并获得了高分辨率的冷冻电镜结构。

IAAG 策略具有用户友好且高效的特点。该策略采用市售的GO/石墨烯/碳膜覆盖的载网和交联剂Pyr-NHS，IAAG载网组装时间不超过2小时，并且该策略无需通过计算去除背景噪音。上述因素使得该方法更具用户友好性和高效性，即使在非专业实验室中也能够使用。此外，IAAG方法具有良好的拓展性，通过使用Pyr-NHS作为linker，还可以将其他抗体、Fab、纳米抗体或诱饵蛋白非共价锚定到上述载网表面，用于亲和纯化和冷冻制样。

综上，采用IAAG亲和载网策略成功实现了低丰度蛋白样品直接从细胞裂解液中on-grid纯化和高分辨率冷冻电镜结构解析，极大简化了繁琐的蛋白质纯化过程，减少了对大量生物样品的需求，并有助于解决冷冻制样中气-液界面相关的常见挑战。IAAG策略高效、易操作，用户友好，且具有很好的拓展性。该方法在冷冻电镜和冷冻电子断层扫描结构研究中具有广泛的应用潜力和拓展性。

分子细胞卓越中心博士研究生赵巧钰和已毕业的硕士研究生洪晓喻为该论文的共同第一作者，丛尧研究员为通讯作者。该研究获得中国科学院、国家自然科学基金委员会、国家科技部和上海市科委等项目的资助；同时得到国家蛋白质科学研究（上海）设施的冷冻电镜系统、数据库与计算分析系统和蛋白质表达纯化系统，分子细胞卓越中心细胞分析技术平台和赛默飞上海纳米港的大力支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s42003-024-06406-z#Sec23

IAAG亲和载网的制备及其在冷冻电镜高分辨率结构研究中的应用。（a）IAAG亲和载网的制备及其应用于从细胞裂解液中特异性亲和纯化目标蛋白的示意图。（b）应用IAAG亲和载网克服酵母源CCT6同源寡聚环（CCT6-HR）复合体的样品分布取向倾向性问题。（c）应用IAAG亲和载网从细胞裂解液中直接on-grid亲和纯化表达量极低的CCT6-HR复合体，并用于高分辨率冷冻电镜结构解析。