2024年8月21日，《eLife》期刊在线发表了题为“An applicable and efficient retrograde monosynaptic circuit mapping tool for larval zebrafish”的研究论文。该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杜旭飞研究平台和杜久林研究组合作完成。该研究实现了一项技术进步，应用重组狂犬病毒（RV）在斑马鱼幼鱼进行遗传可控的跨单级突触的高效神经环路逆向示踪，为以斑马鱼为模式动物的神经科学研究提供新的助力。

幼年斑马鱼因其大脑体积小且透明，已逐渐成为全脑尺度、单细胞分辨率下开展系统神经科学研究的理想脊椎动物模型。研究人员能够在清醒甚至行为中的幼年斑马鱼中实时监测和调控全脑神经元的活动，为解析动物行为的神经机制提供了新的研究范式。在这一领域，接下来的关键步骤是揭示其背后的神经环路机制。在过去近二十年中，基于重组病毒的环路示踪工具在哺乳动物中取得了显著进展，然而在斑马鱼研究领域，这些工具的应用仍然受限。已有的病毒示踪技术在斑马鱼中展现出极低的示踪效率，单个起始细胞的输入标记仅为1个细胞左右，且伴随高毒性，严重限制了其在斑马鱼研究中的应用。因此，该领域亟需可应用且高效的神经环路示踪方法。

该研究通过对包括狂犬病毒（RV）毒株、狂犬病毒糖蛋白（G蛋白）类型、G蛋白表达策略和工作温度在内的多个因素逐步进行组合优化，确定了以CVS毒株为基础的最优组合。该优化组合显著提高了神经环路示踪的效率，较此前报道的最高效率提升了约20倍，并可轻松在斑马鱼中应用。研究人员还发现，此优化组合使得被感染细胞展现出较低的细胞毒性，从而能够在保持被感染神经元功能活性的前提下，将观察持续至3周龄幼鱼，覆盖了斑马鱼全脑功能成像研究的关键时间窗口。同时，该工作首次在斑马鱼上进行了RV传播的功能验证，证明其对斑马鱼中枢神经环路示踪的逆向专一性和跨单级突触特异性。进一步地，研究人员通过使用表达Cre的RV病毒，开发了转基因报告系统，实现了所追踪输入细胞的遗传学控制和高清可视化，这使得输入细胞的类型特异性示踪成为可能，并有助于基于单神经元形态重建示踪的神经环路。为验证其应用潜力，研究团队将该方法应用于示踪斑马鱼幼鱼小脑颗粒细胞（GC）到浦肯野细胞（PC）的单级联接环路，重建了PC的单细胞分辨率输入图谱，揭示了斑马鱼幼鱼小脑GC到PC联接环路的两个新特性：同侧偏好性和亚型特异性。

图: a, 在斑马鱼幼鱼中使用重组RV病毒示踪浦肯野细胞输入的流程图。b, 不同组合策略下示踪浦肯野细胞输入神经元的效率。c, 小脑浦肯野细胞与颗粒细胞间的联接图谱。d, 颗粒细胞到浦肯野细胞的亚型特异性联接模式图。

该研究在斑马鱼幼鱼中实现了遗传可控的高效、低毒性和高可行性的逆向跨单级突触示踪。其有效性和适用性克服了该领域长期以来的技术瓶颈，将促进对斑马鱼神经环路结构和功能的深入解析。

该研究在杜旭飞副研究员和杜久林研究员共同指导下，主要由硕士研究生陈天伦和博士研究生邓秋穗共同完成；中国科学院深圳先进技术研究院林坤章博士提供了重组RV病毒；斑马鱼图谱研究平台郑秀丹、王鑫、钟勇伟、宁欣宇等对该工作也做出了重要贡献。该研究得到了北京脑科学与类脑研究所李莹研究员和中国科学院深圳先进技术研究院徐富强研究员的大力帮助。该研究得到科技部、中国科学院、基金委和上海市的资助。