2025年6月25日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究团队联合张余研究团队以及上海师范大学王文琴研究团队在Nature Plants上发表了题为 “PEN1 catalyses RNA primer removal during plastid DNA replication in maize”的研究论文。科研人员经过八年不懈探索，最终揭示了植物质体DNA（ptDNA）复制体中RNA引物切除的核心核酸酶组分plastid-localized and Mn²⁺-dependent 5’-3’exonuclease 1 (PEN1)。长期以来，植物ptDNA复制中负责RNA引物切除的核酸酶一直未被鉴定到，而PEN1的发现填补了这一关键领域的空缺，完善了ptDNA复制理论。

DNA复制是生命科学的核心基础问题之一。双链DNA解旋后引物酶在模板链上合成RNA引物。前导链仅需合成一个RNA引物即可由高持续合成能力的DNA聚合酶实现连续延伸，而滞后链则需合成多个RNA引物，通过不连续的冈崎片段合成方式完成复制。DNA复制后，RNA引物由核酸酶负责切除，从而保证基因组的完整性。在原核生物中，如大肠杆菌，DNA聚合酶III是主要负责DNA复制的聚合酶，而DNA聚合酶I是负责切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I除了具有聚合酶活性外，还具5′-3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA链时，同步利用其外切酶活性切除RNA引物，这一过程称为缺口翻译（Nick translation）。

在内共生过程中，光合蓝细菌被非光合真核生物整合共生，最终演变成了质体。质体根据其形态和功能的差异，主要分为叶绿体、淀粉体和有色体等，它们分别在光合作用、淀粉合成和代谢调控中扮演着关键角色。尽管功能各异，但所有质体都起源于共同的前体（前质体），并具有相同的遗传物质。质体是半自主的细胞器，Pol1A和1B负责ptDNA的复制；然而，其缺乏DNA聚合酶I类似的5’-3’外切酶结构域。因此，负责ptDNA复制过程RNA引物切除的核酸酶的身份，长期以来一直是一个未解之谜。拟南芥中，AtRNH1C可能参与RNA引物切除；然而，这一过程并非完全高效，AtRNH1C切割后会在RNA-DNA连接处残留1-3个核糖核苷酸，从而抑制DNA片段的连接。因此，研究人员推测还需要其他尚未被鉴定的质体定位的核酸酶来完全切除RNA引物并允许DNA片段连接，从而确保ptDNA复制的成功完成。

2017年，刚进实验室的研究生黄兴和导师巫永睿研究员在山东泰安的夏季试验田里，从甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体分离到pen1突变体。与之前报道的在世代间表现出稳定遗传表型的籽粒突变体不同，pen1胚乳发育和灌浆存在缺陷，且随着世代繁衍加剧的特征。值得注意的是，pen1/+自交分离的纯合突变体（pen1^F2）的胚乳质体发育仅伴随轻微缺陷，而pen1^F2继续自交后代（pen1^F3）的胚乳前质体均不能正常分化，胚乳表现为完全空壳。

研究人员成功分离了Pen1位点，发现其编码质体特异定位的5’-3’外切酶。PEN1与ptDNA复制体的其他成分（Pol1A/1B和连接酶LIG1）共定位于叶绿体拟核。研究表明，PEN1能高效切割RNA引物切除过程中间体，并完全移除RNA-DNA连接处的核糖核苷酸，从而促进了LIG1的连接。研究人员成功在体外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1介导的质体RNA引物去除过程，证实PEN1的确参与了ptDNA复制过程RNA引物移除。

此外，研究人员还解析了PEN1-双链DNA二元复合物的晶体结构。在PEN1的催化中心，被切割DNA链的第1个核苷酸的5’单磷酸基团与活性中心的Mg2+形成配位键、连接第2和第3个核苷酸的磷酸二酯键同时与K250、R264、R283形成三个盐桥，这使得被切割DNA链在活性中心的相对位置被固定，从而使PEN1精确切割1和第2个核苷酸之间的磷酸二酯键，发挥其核酸外切酶活性。为了探究Pen1突变对ptDNA的影响，研究人员通过分离ptDNA和Detail-Seq发现Pen1功能缺失直接导致ptDNA的断裂，且断点主要积累在ptDNA正义链上。同时，研究人员还发现Pen1功能缺失抑制了ptDNA的复制和转录活性，从而影响了质体的正常发育和功能。

对质体遗传和复制机制的系统性阐述，对于理解质体发育和推动植物遗传工程至关重要。尽管已鉴定出越来越多参与ptDNA复制的因子，但负责移除RNA引物的特定组分一直不明确。本研究鉴定到的质体特异性的5’-3’外切酶PEN1能直接催化质体DNA复制过程中RNA引物的移除，并阐明了其结构基础。这些发现为质体复制（尤其是RNA引物移除过程）提供了深刻的见解，助于推动作物改良的质体遗传工程进展。

中国科学院分子植物科学卓越创新中心博士后黄兴，博士生石国龙以及已毕业博士肖俏（现安徽农业大学博士后）为本研究论文的共同第一作者。四川农业大学黄永财教授，上海师范大学研究生冯娇娇等参与了该研究。中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿和张余研究员以及上海师范大学王文琴教授为通讯作者。清华大学生命科学学院植物生物学研究中心孙前文副教授和张卫峰博士在ptDNA损伤检测提供了大量帮助。该研究工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金重点和青A延续，中国科学院先导B，尚思探索学者和国家资助博士后B类等项目的资助。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41477-025-02027-4

PEN1介导ptDNA复制RNA引物的移除